عوامل التداخل في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل

أثناء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، غالبًا ما يتم مواجهة بعض العوامل المتداخلة.
نظرًا للحساسية العالية جدًا لـ PCR ، يعتبر التلوث أحد أهم العوامل التي تؤثر على نتائج PCR ويمكن أن يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة.
بنفس القدر من الأهمية هي المصادر المختلفة التي تؤدي إلى نتائج سلبية خاطئة.إذا تم منع أو تدخل جزء أساسي أو أكثر من خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تفاعل التضخيم نفسه ، فيمكن إعاقة الفحص التشخيصي.هذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض الكفاءة وحتى نتائج سلبية خاطئة.
بالإضافة إلى التثبيط ، قد يحدث فقدان لسلامة الحمض النووي المستهدف بسبب ظروف الشحن و / أو التخزين قبل تحضير العينة.على وجه الخصوص ، قد تؤدي درجات الحرارة المرتفعة أو التخزين غير الكافي إلى تلف الخلايا والأحماض النووية.يعد تثبيت الخلايا والأنسجة ودمج البارافين من الأسباب المعروفة لتفتيت الحمض النووي والمشكلة المستمرة (انظر الشكلين 1 و 2).في هذه الحالات ، لن يساعد حتى العزل والتنقية الأمثل.

الشكل 1 |تأثير التثبيت على سلامة الحمض النووي
أظهر الرحلان الكهربي لهلام Agarose أن جودة الحمض النووي المعزول من مقاطع البارافين في تشريح الجثة تختلف اختلافًا كبيرًا.تم العثور على الحمض النووي بأطوال أجزاء متوسطة مختلفة في المستخلصات اعتمادًا على طريقة التثبيت.تم حفظ الحمض النووي فقط عند تثبيته في عينات مجمدة أصلية وفي الفورمالين المحايد المخزن.أدى استخدام مادة الفورمالين التي تحتوي على حمض الفورميك المحتوي على حمض الفورميك إلى فقدان كبير للحمض النووي.الجزء المتبقي مجزأ للغاية.
على اليسار ، يتم التعبير عن طول الأجزاء في أزواج كيلوباز (kbp)

الشكل 2 |فقدان سلامة أهداف الحمض النووي
(أ) ستؤدي فجوة 3′-5 على كلا الجدولين إلى كسر في الحمض النووي الهدف.سيستمر تخليق الحمض النووي على الجزء الصغير.ومع ذلك ، إذا كان موقع التلدين التمهيدي مفقودًا على جزء الحمض النووي ، يحدث التضخيم الخطي فقط.في الحالة الأكثر ملاءمة ، قد تشبع الشظايا بعضها البعض ، لكن العوائد ستكون صغيرة وأقل من مستويات الكشف.
(ب) يؤدي فقدان القواعد ، ويرجع ذلك أساسًا إلى إزالة الترسبات وتكوين ثيميدين ثيميدين ، إلى انخفاض في عدد روابط H وانخفاض في Tm.أثناء مرحلة التسخين المطول ، سوف تذوب البادئات بعيدًا عن DNA المصفوفة ولن تصلب حتى في ظل ظروف أقل صرامة.
(ج) تشكل قواعد الثايمين المجاورة ثايمر TT.
هناك مشكلة شائعة أخرى تحدث غالبًا في التشخيص الجزيئي وهي الإطلاق الأقل من الأمثل للأحماض النووية المستهدفة مقارنة باستخراج الفينول كلوروفورم.في الحالات القصوى ، يمكن أن يرتبط هذا بسلبيات كاذبة.يمكن توفير الكثير من الوقت عن طريق غليان التحلل أو الهضم الأنزيمي لحطام الخلية ، ولكن هذه الطريقة غالبًا ما تؤدي إلى انخفاض حساسية تفاعل البوليميراز المتسلسل بسبب عدم كفاية إطلاق الحمض النووي.

تثبيط نشاط البلمرة أثناء التضخيم

بشكل عام ، يتم استخدام التثبيط كمفهوم حاوية لوصف جميع العوامل التي تؤدي إلى نتائج PCR دون المستوى الأمثل.بالمعنى الكيميائي الحيوي الصارم ، يقتصر التثبيط على نشاط الإنزيم ، أي أنه يقلل أو يمنع تحويل الركيزة المنتج من خلال التفاعل مع الموقع النشط لبوليميراز الحمض النووي أو العامل المساعد له (على سبيل المثال ، Mg2 + لـ Taq DNA polymerase).
يمكن للمكونات الموجودة في العينة أو مختلف المحاليل والمستخلصات المحتوية على الكواشف أن تثبط الإنزيم بشكل مباشر أو تحبس عوامله المساعدة (على سبيل المثال EDTA) ، وبالتالي تعطيل البوليميراز ، مما يؤدي بدوره إلى انخفاض نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل السلبي أو الخاطئ.
ومع ذلك ، فإن العديد من التفاعلات بين مكونات التفاعل والأحماض النووية المحتوية على الهدف تم تصنيفها أيضًا على أنها "مثبطات PCR".بمجرد أن تتعطل سلامة الخلية عن طريق العزل ويتم إطلاق الحمض النووي ، يمكن أن تحدث تفاعلات بين العينة والمحلول المحيط بها والمرحلة الصلبة.على سبيل المثال ، يمكن لـ "الزبالين" ربط الحمض النووي أحادي أو مزدوج السلسلة من خلال التفاعلات غير التساهمية والتدخل في العزل والتنقية عن طريق تقليل عدد الأهداف التي تصل في النهاية إلى وعاء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.
بشكل عام ، توجد مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل في معظم سوائل الجسم والكواشف المستخدمة في الاختبارات التشخيصية السريرية (اليوريا في البول ، والهيموجلوبين والهيبارين في الدم) ، والمكملات الغذائية (المكونات العضوية ، والجليكوجين ، والدهون ، وأيونات الكالسيوم) والمكونات الموجودة في البيئة (الفينولات). ، معادن ثقيلة)

يمكن العثور على مثبطات PCR الأكثر انتشارًا في البكتيريا والخلايا حقيقية النواة ، والحمض النووي غير المستهدف ، والجزيئات الكبيرة المرتبطة بالحمض النووي في مصفوفات الأنسجة ، ومعدات المختبرات مثل القفازات والبلاستيك.تنقية الأحماض النووية أثناء الاستخراج أو بعده هي الطريقة المفضلة لإزالة مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل.
اليوم ، يمكن لمعدات الاستخراج المؤتمتة المختلفة أن تحل محل العديد من البروتوكولات اليدوية ، ولكن لم يتم تحقيق استرداد و / أو تنقية الأهداف بنسبة 100٪.قد تظل المثبطات المحتملة موجودة في الأحماض النووية المنقاة أو قد تكون سارية بالفعل.توجد استراتيجيات مختلفة للحد من تأثير المثبطات.يمكن أن يكون لاختيار البوليميراز المناسب تأثير كبير على نشاط المانع.الطرق الأخرى التي أثبتت جدواها لتقليل تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل هي زيادة تركيز البوليميراز أو تطبيق مواد مضافة مثل مساحة سطح الجسم.
يمكن إثبات تثبيط تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مراقبة جودة العملية الداخلية (IPC).
يجب توخي الحذر لإزالة جميع الكواشف والحلول الأخرى في مجموعة الاستخراج ، مثل الإيثانول ، EDTA ، CETAB ، LiCl ، GuSCN ، SDS ، الأيزوبروبانول والفينول ، من عزل الحمض النووي عن طريق خطوة غسل شاملة.اعتمادًا على تركيزهم ، قد ينشطون أو يثبطون تفاعل البوليميراز المتسلسل.