عوامل التدخل في تفاعلات PCR

أثناء تفاعل PCR، غالبًا ما تتم مواجهة بعض العوامل المتداخلة.
نظرًا للحساسية العالية جدًا لتفاعل البوليميراز المتسلسل، يعتبر التلوث أحد أهم العوامل التي تؤثر على نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل ويمكن أن يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة.
بنفس القدر من الأهمية هي المصادر المختلفة التي تؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة. إذا تم تثبيط أو التدخل في واحد أو أكثر من الأجزاء الأساسية من خليط PCR أو تفاعل التضخيم نفسه، فقد يتم إعاقة الاختبار التشخيصي. وهذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض الكفاءة وحتى نتائج سلبية كاذبة.
بالإضافة إلى التثبيط، قد يحدث فقدان سلامة الحمض النووي المستهدف بسبب ظروف الشحن و/أو التخزين قبل إعداد العينة. على وجه الخصوص، قد تؤدي درجات الحرارة المرتفعة أو التخزين غير الكافي إلى تلف الخلايا والأحماض النووية. يعد تثبيت الخلايا والأنسجة وتضمين البارافين من الأسباب المعروفة لتفتيت الحمض النووي ومشكلة مستمرة (انظر الشكلين 1 و 2). في هذه الحالات، حتى العزلة والتنقية المثالية لن تساعد.

الشكل 1 | تأثير الشلل على سلامة الحمض النووي
أظهر الفصل الكهربائي لهلام الاغاروز أن جودة الحمض النووي المعزول من مقاطع البارافين في التشريح تباينت بشكل كبير. كان الحمض النووي ذو أطوال الأجزاء المختلفة موجودًا في المستخلصات اعتمادًا على طريقة التثبيت. تم الحفاظ على الحمض النووي فقط عند تثبيته في العينات المجمدة الأصلية وفي الفورمالين المحايد المخزن. أدى استخدام مثبت البوين شديد الحموضة أو الفورمالين المحتوي على حمض الفورميك إلى خسارة كبيرة في الحمض النووي. الجزء المتبقي مجزأ للغاية.
على اليسار، يتم التعبير عن طول الأجزاء بأزواج كيلو قاعدة (kbp)

الشكل 2 | فقدان سلامة أهداف الحمض النووي
(أ) ستؤدي الفجوة 3′-5′ في كلا الشريطين إلى انقطاع في الحمض النووي المستهدف. سيظل تصنيع الحمض النووي يحدث على الجزء الصغير. ومع ذلك، إذا كان موقع التلدين التمهيدي مفقودًا على جزء الحمض النووي، يحدث التضخيم الخطي فقط. في الحالة الأكثر ملائمة، قد تقوم الأجزاء بإعادة تشبع بعضها البعض، ولكن النتائج ستكون صغيرة وأقل من مستويات الكشف.
(ب) يؤدي فقدان القواعد، والذي يرجع بشكل رئيسي إلى إزالة البيورين وتكوين ثنائي الثيميدين، إلى انخفاض في عدد روابط H وانخفاض في Tm. أثناء مرحلة الاحترار المطولة، سوف تذوب البادئات بعيدًا عن الحمض النووي المصفوفي ولن تصلب حتى في ظل ظروف أقل صرامة.
(ج) تشكل قواعد الثيمين المجاورة ثنائي TT.
هناك مشكلة شائعة أخرى تحدث غالبًا في التشخيص الجزيئي وهي الإطلاق الأقل من الأمثل للأحماض النووية المستهدفة مقارنة باستخراج الفينول كلوروفورم. في الحالات القصوى، يمكن أن يرتبط هذا بالسلبيات الكاذبة. يمكن توفير الكثير من الوقت عن طريق الغليان أو الهضم الأنزيمي لحطام الخلية، ولكن هذه الطريقة غالبًا ما تؤدي إلى انخفاض حساسية PCR بسبب عدم كفاية إطلاق الحمض النووي.

تثبيط نشاط البلمرة أثناء التضخيم

بشكل عام، يتم استخدام التثبيط كمفهوم حاوية لوصف جميع العوامل التي تؤدي إلى نتائج PCR دون المستوى الأمثل. بالمعنى الكيميائي الحيوي الدقيق، يقتصر التثبيط على نشاط الإنزيم، أي أنه يقلل أو يمنع تحويل منتج الركيزة من خلال التفاعل مع الموقع النشط لبوليميراز DNA أو العامل المساعد الخاص به (على سبيل المثال، Mg2+ لبوليميراز DNA Taq).
يمكن للمكونات الموجودة في العينة أو المحاليل المنظمة والمستخلصات المختلفة التي تحتوي على كواشف أن تمنع الإنزيم بشكل مباشر أو تحجز عوامله المساعدة (مثل EDTA)، وبالتالي تعطل نشاط البلمرة وتؤدي بدورها إلى نتائج PCR سلبية منخفضة أو كاذبة.
ومع ذلك، فإن العديد من التفاعلات بين مكونات التفاعل والأحماض النووية المحتوية على الهدف يتم تصنيفها أيضًا على أنها "مثبطات PCR". بمجرد تعطل سلامة الخلية عن طريق العزلة وإطلاق الحمض النووي، يمكن أن تحدث تفاعلات بين العينة والمحلول المحيط بها والطور الصلب. على سبيل المثال، يمكن لـ "الزبالون" ربط الحمض النووي المفرد أو المزدوج من خلال تفاعلات غير تساهمية والتدخل في العزل والتنقية عن طريق تقليل عدد الأهداف التي تصل في النهاية إلى وعاء تفاعل PCR.
بشكل عام، تتواجد مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل في معظم سوائل الجسم والكواشف المستخدمة في اختبارات التشخيص السريري (اليوريا في البول والهيموجلوبين والهيبارين في الدم)، والمكملات الغذائية (المكونات العضوية، والجليكوجين، والدهون، وأيونات الكالسيوم +) والمكونات الموجودة في البيئة (الفينولات). والمعادن الثقيلة)

يمكن العثور على مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل الأكثر انتشارًا في البكتيريا والخلايا حقيقية النواة، والحمض النووي غير المستهدف، والجزيئات الكبيرة المرتبطة بالحمض النووي في مصفوفات الأنسجة، ومعدات المختبرات مثل القفازات والمواد البلاستيكية. تعد تنقية الأحماض النووية أثناء أو بعد الاستخراج هي الطريقة المفضلة لإزالة مثبطات PCR.
اليوم، يمكن لمعدات الاستخراج الآلية المختلفة أن تحل محل العديد من البروتوكولات اليدوية، ولكن لم يتم تحقيق استرداد و/أو تنقية الأهداف بنسبة 100%. ربما لا تزال المثبطات المحتملة موجودة في الأحماض النووية النقية أو ربما تكون قد أصبحت فعالة بالفعل. توجد استراتيجيات مختلفة للحد من تأثير المثبطات. اختيار البوليميراز المناسب يمكن أن يكون له تأثير كبير على نشاط المثبط. هناك طرق أخرى مثبتة لتقليل تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل هي زيادة تركيز البوليميراز أو استخدام إضافات مثل BSA.
يمكن إثبات تثبيط تفاعلات PCR من خلال استخدام مراقبة جودة العملية الداخلية (IPC).
يجب الحرص على إزالة جميع الكواشف والحلول الأخرى في مجموعة الاستخراج، مثل الإيثانول، EDTA، CETAB، LiCl، GuSCN، SDS، الأيزوبروبانول والفينول، من عزل الحمض النووي بخطوة غسيل شاملة. اعتمادا على تركيزها، فإنها قد تنشط أو تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل.