عوامل التداخل في تفاعلات PCR

أثناء رد فعل PCR ، غالبًا ما يتم مواجهة بعض العوامل المتداخلة.
نظرًا للحساسية العالية للغاية لـ PCR ، يعتبر التلوث أحد أهم العوامل التي تؤثر على نتائج PCR ويمكن أن تنتج نتائج إيجابية خاطئة.
بنفس القدر من الأهمية هي المصادر المختلفة التي تؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة. إذا تم تثبيط أو تداخل جزءًا أساسيًا أو أكثر من خليط PCR أو تفاعل التضخيم نفسه ، فيمكن إعاقة الفحص التشخيصي. هذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض الكفاءة وحتى نتائج سلبية خاطئة.
بالإضافة إلى تثبيط ، قد يحدث فقدان سلامة الحمض النووي المستهدف بسبب الشحن و/أو ظروف التخزين قبل تحضير العينة. على وجه الخصوص ، قد يؤدي درجات الحرارة المرتفعة أو التخزين غير الكافي إلى تلف الخلايا والأحماض النووية. يعد تثبيت الخلايا والأنسجة وتضمين البارافين أسبابًا معروفة لتفتت الحمض النووي ومشكلة مستمرة (انظر الشكلين 1 و 2). في هذه الحالات ، حتى العزلة الأمثل والتنقية لن تساعد.

الشكل 1 | تأثير الشلل على سلامة الحمض النووي
أظهرت agarose هلام الكهربائي أن جودة الحمض النووي المعزولة من أقسام البارافين من تشريح الجثث تباينت بشكل كبير. كان الحمض النووي من متوسط ​​أطوال الشظية المختلفة موجودة في المستخلصات اعتمادًا على طريقة التثبيت. تم الحفاظ على الحمض النووي فقط عند تثبيته في عينات المجمدة الأصلية وفي الفورمالين المحايد المخزنة. أدى استخدام مثبتة حمضية قوية أو غير محتوية على الفورمالين ، مما أدى إلى فقدان كبير في الحمض النووي. الكسر المتبقي مجزأ للغاية.
على اليسار ، يتم التعبير عن طول الشظايا في أزواج كيلوباس (KBP)

الشكل 2 | فقدان سلامة أهداف الحمض النووي
(أ) الفجوة 3′-5 ′ على كلا الخيوطين ستؤدي إلى كسر في الحمض النووي المستهدف. سيظل توليف الحمض النووي على الشظية الصغيرة. ومع ذلك ، إذا كان موقع الصلب التمهيدي مفقودًا على جزء الحمض النووي ، فإن التضخيم الخطي فقط يحدث. في الحالات الأكثر ملاءمة ، قد تعيد الشظايا أن تشتهر بعضها البعض ، لكن العوائد ستكون صغيرة وأقل من مستويات الكشف.
(ب) فقدان القواعد ، ويرجع ذلك أساسا إلى إزالة التثبيط وتشكيل ثيميدين ، يؤدي إلى انخفاض في عدد الرابطة H وانخفاض في TM. خلال مرحلة الاحترار المطولة ، ستذوب الاشعال بعيدًا عن DNA المصفوفة ولن يلد حتى في ظل ظروف أقل صرامة.
(ج) قواعد الثيمين المجاورة تشكل TT Dimer.
هناك مشكلة شائعة أخرى تحدث غالبًا في التشخيصات الجزيئية وهي الإفراج عن الأحماض النووية المستهدفة أقل من الأمثل مقارنة باستخراج الفينول كلوروفورم. في الحالات القصوى ، يمكن أن يرتبط هذا بالسلبيات الخاطئة. يمكن حفظ الكثير من الوقت عن طريق تحلل الغليان أو الهضم الأنزيمي لحطام الخلية ، ولكن هذه الطريقة غالبًا ما تؤدي إلى انخفاض حساسية PCR بسبب إطلاق الحمض النووي الكافي.

تثبيط نشاط البلمرة أثناء التضخيم

بشكل عام ، يتم استخدام تثبيط كمفهوم حاوية لوصف جميع العوامل التي تؤدي إلى نتائج PCR دون المستوى الأمثل. بالمعنى الكيميائي الحيوي الصارم ، يقتصر تثبيط على نشاط الإنزيم ، أي أنه يقلل أو يمنع تحويل المنتجات للركيزة من خلال التفاعل مع الموقع النشط لبوليميريز الحمض النووي أو العامل المساعد (على سبيل المثال ، MG2+ لبوليميريز DNA TAQ).
يمكن أن تمنع المكونات الموجودة في العينة أو المخازن المؤقتة والمستخلصات المختلفة التي تحتوي على الكواشف بشكل مباشر الإنزيم أو فخ العوامل المساعدة (على سبيل المثال EDTA) ، مما يؤدي إلى تعطيل البوليميريز وبالتالي يؤدي إلى انخفاض أو نتائج PCR السلبية الخاطئة.
ومع ذلك ، يتم تعيين العديد من التفاعلات بين مكونات التفاعل والأحماض النووية التي تحتوي على الهدف على أنها "مثبطات PCR". بمجرد تعطيل سلامة الخلية عن طريق العزلة ويتم إطلاق الحمض النووي ، يمكن أن تحدث التفاعلات بين العينة والمحلول المحيط بها والمرحلة الصلبة. على سبيل المثال ، يمكن أن يربط "الزبالون" الحمض النووي المفرد أو المزدوج من خلال التفاعلات غير التساهمية ويتداخل مع العزلة والتنقية عن طريق تقليل عدد الأهداف التي تصل في النهاية إلى وعاء تفاعل PCR.
بشكل عام ، توجد مثبطات PCR في معظم سوائل الجسم والكواشف المستخدمة في الاختبارات التشخيصية السريرية (اليوريا في البول والهيموغلوبين والهيبارين في الدم) ، والمكملات الغذائية (المكونات العضوية ، والجليكوجين ، والدهون ، و CA2+ أيونات) في البيئة (الفينول ، والمعادن الثقيلة)

يمكن العثور على مثبطات PCR الأكثر انتشارًا في البكتيريا والخلايا حقيقية النواة ، والحمض النووي غير المستهدفة ، والجزيئات المرتبطة بالحمض النووي لمصفوفات الأنسجة ومعدات المختبر مثل القفازات والمواد البلاستيكية. تنقية الأحماض النووية أثناء أو بعد الاستخراج هي الطريقة المفضلة لإزالة مثبطات PCR.
اليوم ، يمكن أن تحل العديد من معدات الاستخراج الآلية محل العديد من البروتوكولات اليدوية ، ولكن لم يتم تحقيق الاسترداد و/أو تنقية الأهداف بنسبة 100 ٪. قد تظل مثبطات محتملة موجودة في الأحماض النووية النقية أو ربما تكون قد أسرّت بالفعل. توجد استراتيجيات مختلفة لتقليل تأثير مثبطات. يمكن أن يكون لاختيار البلمرة المناسبة تأثير كبير على نشاط المانع. الأساليب الأخرى المثبتة لتقليل تثبيط PCR هي زيادة تركيز البلمرة أو تطبيق إضافات مثل BSA.
يمكن إثبات تثبيط تفاعلات PCR من خلال استخدام مراقبة جودة العملية الداخلية (IPC).
يجب توخي الحذر لإزالة جميع الكواشف والحلول الأخرى في مجموعة الاستخراج ، مثل الإيثانول ، EDTA ، CETAB ، LECL ، GUSCN ، SDS ، الأيزوبروبانول والفينول ، من الحمض النووي عزلها بخطوة غسل شاملة. اعتمادًا على تركيزها ، قد يقومون بتنشيط أو يمنع PCR.