عوامل التداخل في تفاعلات PCR

أثناء تفاعل PCR، غالبًا ما يتم مواجهة بعض العوامل المتداخلة.
بسبب الحساسية العالية جدًا لـ PCR، يعتبر التلوث أحد أهم العوامل التي تؤثر على نتائج PCR ويمكن أن يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة.
لا تقل أهميةً المصادرُ المختلفةُ التي تُؤدي إلى نتائج سلبية خاطئة. فإذا تم تثبيطُ أو التداخلُ مع جزءٍ أساسيٍّ أو أكثر من خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو تفاعل التضخيم نفسه، فقد يُعيق ذلك إجراءَ الفحص التشخيصي. وهذا قد يؤدي إلى انخفاض الكفاءة، بل وحتى إلى نتائج سلبية خاطئة.
بالإضافة إلى التثبيط، قد يحدث فقدان لسلامة الحمض النووي المستهدف نتيجةً لظروف الشحن و/أو التخزين قبل تحضير العينة. وعلى وجه الخصوص، قد تؤدي درجات الحرارة المرتفعة أو التخزين غير المناسب إلى تلف الخلايا والأحماض النووية. يُعد تثبيت الخلايا والأنسجة والتضمين بالبارافين من الأسباب المعروفة لتفتت الحمض النووي، وهي مشكلة مستمرة (انظر الشكلين 1 و2). في هذه الحالات، حتى العزل والتنقية الأمثل لن يُجدي نفعًا.

الشكل 1 | تأثير التثبيت على سلامة الحمض النووي
أظهر التحليل الكهربائي لهلام الأغاروز تفاوتًا كبيرًا في جودة الحمض النووي المعزول من مقاطع البارافين في عينات التشريح. وُجدت شظايا الحمض النووي بأطوال متوسطة مختلفة في المستخلصات، وذلك وفقًا لطريقة التثبيت. ولم يُحفظ الحمض النووي إلا عند تثبيته في عينات مجمدة طبيعية وفي فورمالين محايد مُنظّم. وأدى استخدام مُثبّت بوين شديد الحموضة أو فورمالين غير مُنظّم يحتوي على حمض الفورميك إلى فقدان كبير في الحمض النووي. أما الجزء المتبقي، فهو شديد التفتت.
على اليسار، يتم التعبير عن طول الأجزاء بأزواج كيلوباس (kbp)

الشكل 2 | فقدان سلامة أهداف الأحماض النووية
(أ) ستؤدي الفجوة 3'-5' على كلا السلسلتين إلى كسر في الحمض النووي المستهدف. سيظل تركيب الحمض النووي مستمرًا على القطعة الصغيرة. ومع ذلك، في حال عدم وجود موقع تلدين بادئ على قطعة الحمض النووي، يحدث تضخيم خطي فقط. في أفضل الأحوال، قد تُشبع القطع بعضها البعض، لكن النتائج ستكون ضئيلة وأقل من مستويات الكشف.
(ب) يؤدي فقدان القواعد، الناتج أساسًا عن إزالة البيورين وتكوين ثنائي الثيميدين، إلى انخفاض عدد الروابط الهيدروجينية وانخفاض درجة الحرارة. خلال مرحلة التسخين المُطوّلة، تذوب البادئات بعيدًا عن الحمض النووي للمصفوفة، ولن تتصلب حتى في ظل ظروف أقل صرامة.
(ج) تشكل قواعد الثايمين المتجاورة ثنائي TT.
من المشاكل الشائعة الأخرى التي تحدث غالبًا في التشخيص الجزيئي عدم كفاية إطلاق الأحماض النووية المستهدفة مقارنةً باستخلاص الفينول-كلوروفورم. في الحالات القصوى، قد يرتبط هذا بنتائج سلبية خاطئة. يمكن توفير الكثير من الوقت عن طريق التحلل بالغليان أو الهضم الإنزيمي لبقايا الخلايا، إلا أن هذه الطريقة غالبًا ما تؤدي إلى انخفاض حساسية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بسبب عدم كفاية إطلاق الأحماض النووية.

تثبيط نشاط البوليميراز أثناء التضخيم

بشكل عام، يُستخدم التثبيط كمفهوم شامل لوصف جميع العوامل التي تؤدي إلى نتائج غير مثالية في تفاعل البوليميراز المتسلسل. بالمعنى البيوكيميائي البحت، يقتصر التثبيط على نشاط الإنزيم، أي أنه يقلل أو يمنع تحويل المادة إلى ناتج من خلال التفاعل مع الموقع النشط لبوليميراز الحمض النووي أو عامله المساعد (مثل Mg2+ لبوليميراز الحمض النووي Taq).
يمكن للمكونات الموجودة في العينة أو المحاليل المختلفة والمستخلصات التي تحتوي على الكواشف أن تمنع الإنزيم بشكل مباشر أو تحبس العوامل المساعدة له (على سبيل المثال EDTA)، وبالتالي تعطيل البوليميراز وبالتالي يؤدي إلى انخفاض نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل أو نتائج سلبية خاطئة.
ومع ذلك، تُسمى العديد من التفاعلات بين مكونات التفاعل والأحماض النووية التي تحتوي على الهدف أيضًا "مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل". بمجرد تعطل سلامة الخلية نتيجةً للعزل وإطلاق الحمض النووي، قد تحدث تفاعلات بين العينة والمحلول المحيط بها والطور الصلب. على سبيل المثال، يمكن لـ"الزبالين" الارتباط بالحمض النووي أحادي أو ثنائي السلسلة من خلال تفاعلات غير تساهمية، مما يتداخل مع العزل والتنقية عن طريق تقليل عدد الأهداف التي تصل في النهاية إلى وعاء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.
بشكل عام، توجد مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل في معظم سوائل الجسم والكواشف المستخدمة في الاختبارات التشخيصية السريرية (اليوريا في البول، والهيموجلوبين والهيبارين في الدم)، والمكملات الغذائية (المكونات العضوية، الجليكوجين، الدهون، أيونات الكالسيوم) والمكونات الموجودة في البيئة (الفينولات، المعادن الثقيلة).

يمكن العثور على مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الأكثر شيوعًا في البكتيريا والخلايا حقيقية النواة، والحمض النووي غير المستهدف، والجزيئات الكبيرة المرتبطة به في مصفوفات الأنسجة، ومعدات المختبرات مثل القفازات والبلاستيك. يُعدّ تنقية الأحماض النووية أثناء الاستخلاص أو بعده الطريقة المُفضّلة لإزالة مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل.
اليوم، يُمكن لمعدات الاستخلاص الآلية المختلفة أن تُغني عن العديد من البروتوكولات اليدوية، ولكن لم يتم تحقيق استخلاص و/أو تنقية 100% للأهداف. قد لا تزال المثبطات المحتملة موجودة في الأحماض النووية المُنقّاة، أو قد تكون قد بدأت مفعولها بالفعل. توجد استراتيجيات مختلفة لتقليل تأثير المثبطات. يُمكن أن يُؤثر اختيار البوليميراز المُناسب بشكل كبير على نشاط المثبط. ومن الطرق الأخرى المُجرّبة لتقليل تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) زيادة تركيز البوليميراز أو استخدام مُضافات مثل BSA.
يمكن إثبات تثبيط تفاعلات PCR عن طريق استخدام مراقبة جودة العملية الداخلية (IPC).
يجب توخي الحذر لإزالة جميع الكواشف والمحاليل الأخرى الموجودة في مجموعة الاستخلاص، مثل الإيثانول، وEDTA، وCETAB، وLiCl، وGuSCN، وSDS، والأيزوبروبانول، والفينول، من عزل الحمض النووي عن طريق غسلها جيدًا. وحسب تركيزها، قد تُنشّط أو تُثبّط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).